Исследование частичного снижения интенсивности симптомов синдрома Ретта при применении Омега-3 ПНЖК

Клаудио Де Фелис • Синтия Синьорини • Тьерри Дюран • Лусия Чикколи • Сильвия Леончини • Маурицио Д’Эспозито • Стефания Филоза • Камиль Огер • Александр Гай • Валери Бутель-Понс • Жан-Мари Галано • Алессандра Пекорелли • Лаура Де Фелис • Джузеппе Валаччи • Джозеф Хейек

Получено: 6 декабря 2011 г./Принято в печать: 30 января 2012 г.

© Спрингер-Верлаг 2012 г.

Резюме: Установлено, что у пациентов с синдромом Ретта (RTT) происходит более интенсивный окислительный стресс (ОС) и перекисное окисление липидов. Синдром Ретта — относительно редкое заболевание, связанное с нарушением развития нервной системы. Причиной данной патологии являются мутации, вызывающие утрату функции метил-CpG-связывающего белка 2. В процессе прогрессирования заболевания различают 4 стадии. В настоящее время не существует эффективных методов терапии для профилактики или остановки неврологической регрессии при различных формах проявления заболевания. Исходя из полученных нами ранее данных об усилении ОС и перекисного окисления липидов у пациентов с RTT, мы проверили гипотезу о возможных терапевтических эффектах ω-3 полиненасыщенных жирных кислот (ω-3 PUFAs), обладающих, как известно, различными формами антиоксидантной активности, на клинические симптомы и биомаркеры ОС на самой ранней стадии RTT. В общей сложности 20 пациентов с заболеванием I стадии были рандомизированы (n = 10 пациентов на группу) в группу применения пероральной добавки ω-3 PUFAs в составе рыбьего жира (DHA: 72.9 ± 8.1 мг/кг веса тела/день; EPA: 117.1 ± 13.1 мг/ кг веса тела/день; всего ω-3 PUFAs: 246.0 ± 27.5 мг/кг веса тела/день) в течение 6 месяцев, или в контрольную группу, где лечение не проводилось. Первичными исходами были возможные изменения клинических симптомов, в качестве вторичных исходов использовали такие параметры как вариабельность пяти маркеров ОС в плазме и/или эритроцитах (железо небелкового связывания, F2 -дигомо-изопростаны, F3 -изопростаны, F4 -нейропростаны, а также F2 -изопростаны). Наблюдалось статистически значимое снижение степени клинической тяжести заболевания (в частности, двигательных симптомов, дефицита невербальной коммуникации, а также аномалий в работе дыхательной системы), наряду со статистически значимым уменьшением всех изученных маркеров ОС, у пациентов, получавших добавки ω-3 PUFAs, тогда как не было зафиксировано статистически значимых изменений в контрольной группе, не получавшей лечения. Это первое исследование, результаты которого доказывают, что применение нутрициологической интервенциональной меры на ранней стадии развития генетического заболевания может обеспечить частичную клиническую и биохимическую сохранность.

Ключевые слова: синдром Ретта • MeCP2 • окислительный стресс • ω-3 полиненасыщенные жирные кислоты • изопростаны • железо небелкового связывания • антиоксиданты

Сокращения

AA Арахидоновая кислота

AdA Адреновая кислота

CDKL5 Циклин-зависимая киназа 5

F2-дигомо-IsoPs F2-дигомо-изопростаны

FOXG1 Белок Forkhead box G1

GC/NICI-MS/MS Газовая хроматография/тандемная масс-спектрометрия отрицательных ионов, полученных при химической ионизации

IsoPs Изопростаны

MeCP2 Метил-CpG-связывающий белок 2

NPBI Железо небелкового связывания

ОС Окислительный стресс

RTT Синдром Ретта

Введение

Классический синдром Ретта (RTT) в 90–95% случаев вызывается мутациями, являющимися причиной утраты функции гена метил-CpG-связывающего белка 2 (MeCP2), расположенного на X хромосоме (Amir et al. 1999). Это вторая наиболее распространенная причина тяжелой задержки умственного развития у женщин (Rett 1966; Hagberg et al. 1983). RTT встречается с частотой до 1/10000 живых рождений девочек. Обычно после периода объективно нормального развития в течение 6–18 месяцев у девочек с RTT происходит утрата приобретенных когнитивных, социальных, а также двигательных навыков, причем регрессия происходит в 4 этапа (Hagberg et al. 1983; Leoncini et al. 2011). В результате появляются признаки аутического поведения, сопровождаемого стереотипными движениями рук. Дальнейшее ухудшение ведет к появлению тяжелой задержки умственного развития и нарушению двигательной активности, включая атаксию, апраксию и тремор. Обычными явлениями могут быть судороги, гипервентиляция и апноэ (Chahrour и Zoghbi 2007). У части пациентов с RTT, у которых нет мутации MeCP2, были обнаружены мутации родственных генов, таких как ген циклин-зависимой киназы 5 (CDKL5) (Mari et al. 2005), взаимодействующих с MeCP2 и белком Forkhead box G1 (FOXG1) при врожденной форме заболевания (Ariani et al. 2008). На сегодняшний день не существует эффективных методов лечения для профилактики или остановки неврологической регрессии разных клинических форм заболевания. Состоянием, эквивалентным в анатомическом отношении дефициту MeCP2, является уменьшение размера мозга, что, возможно, обусловлено уменьшением размеров таких зон мозга как фронтальные и височные доли, хвостатое ядро, таламус, средний мозг, а также мозжечок. Аналогичные изменения были задокументированы у пациентов с RTT, в то же время на клеточном уровне сома нейрона меньше в отсутствие MeCP2, при этом клетки расположены более плотно. В случаях RTT отмечены постсинаптические морфологические дефекты (уменьшение количества ответвлений дендритов, уменьшение плотности дендритов в спинном мозге, а также дефекты в морфологии спинного мозга) и аномалии пресинапса, например, аномальное количество аксонов и дефект мишени аксона, что, в совокупности, приводит к уменьшению количества синапсов в мозге, на фоне аномального баланса между возбуждением/ торможением, при этом в гиппокамп, кору и ствол головного мозга передается больше сигналов возбуждения, чем торможения (подробный отчет об этих и других аспектах дефицита MeCP2 представлен в работе Guy et al. 2011). В целом, данные, полученные как при изучении пациентов с дефицитом MeCP2, так и в экспериментах на мышах, указывают на то, что утрата MeCP2 приводит к нарушению работы многочисленных синапсов в мозге, результатом является создание менее эффективных нейронных сетей и появление фенотипа, напоминающего RTT. Более того, данные, полученные в экспериментах на мышах, у которых отсутствует MeCP2 в γ-аминомасляно-эргических ((GABA)-эргических) нейронах, показывают, что наличие MeCP2 — критически важное условие для нормального функционирования GABA-эргических нейронов, и даже незначительное нарушение функции GABA-эргических нейронов вызывает многочисленные нейропсихические отклонения (Chao et al. 2010). Однако, несмотря на почти два десятилетия изучения функций и роли MeCP2, в настоящее время известно удивительно мало о механизмах, связывающих дефицит MeCP2 с проявлениями заболевания, при этом до сих пор нет убедительного ответа на ряд вопросов о роли MeCP2 в мозге (Guy et al. 2011), и даже само представление о RTT как о заболевании, связанном исключительно с нервной системой, ставится под сомнение (Zoghbi 2009). MeCP2, основной регулятор транскрипции, оказывает исключительно важное влияние на процесс метилирования ДНК (Macdonald et al. 2010). Считается, что MeCP2 через связывание с корепрессорами может подавлять процесс транскрипции, однако при этом имеются сведения также о том, что MeCP2 может активировать транскрипцию в специфических зонах мозга (Chahrour et al. 2008; BenShachar et al. 2009).

На терапевтическом уровне критическим важным обстоятельством является потенциальная обратимость симптомов RTT при проведении экспериментов на мышах (Guy et al. 2007). Это доказывает, что в организме пациентов не происходит гибели нейронов, и подтверждает правильность гипотезы, согласно которой MeCP2 необходим для стабилизации и поддержания зрелого состояния нейрона. Это было доказано в эксперименте на мышах, где удавалось возобновить экспрессию MeCP2 в зависимости от возраста животного. Постнатальная активация MeCP2 у нулевых мышей приводит к исчезновению всех симптомов, напоминающих RTT, в результате чего пролеченные мыши становятся неотличимы от мышей дикого типа. Эти исследования являются источниками ценной информации, позволяющей глубже понять возможности «манипулирования» клиническими признаками RTT, и полезны для определения направления будущих исследований по разработке стратегий лечения (Cobb et al. 2010). Однако подобные стратегии нельзя непосредственно применить для лечения RTT у человека по двум основным причинам: во-первых, организм пациентов мозаичен, половина клеток экспрессирует MeCP2 на уровне дикого типа из-за инактивации X хромосомы; кроме того, неустановленный избыток белка, как и его незначительный дефицит, может влиять на здоровье (Matarazzo et al. 2009), как видно в эксперименте на мышах с повышенной экспрессией MeCP2 (Collins et al. 2004).

Моделирование RTT может лучше понять биологические основы данного синдрома на молекулярном уровне, выявить характер взаимосвязи между метилированием ДНК и симптомами заболевания, что может открыть новые перспективы в лечении болезни. Были выдвинуты разные предположения о том, какие молекулы или стратегии (в том числе генная терапия (Guy et al. 2007)) могут частично улучшить состояние больных или вызывать частичное возвращение к норме клинических симптомов (дезипрамин, ампакин, IGF1 (Ogier et al. 2007; Roux et al. 2007; Tropea et al. 2009)). У нулевых мышей (без MeCP2) имеются нарушения частоты дыхания, что обычно объясняют изменениями нейронов ствола мозга (Viemari et al. 2005). Было доказано, что некоторые варианты фармакологического лечения эффективно снимают респираторные симптомы при проведении экспериментов на мышах. Следует также отметить, что аналогичные симптомы часто (в 26% случаев) являются причиной смерти у пациентов с RTT, хотя механизм действия препаратов в таких случаях по-прежнему неясен.

Заместительная терапия рекомбинантными белками TAT-MeCP2 (Laccone, личное сообщение) и использование соматических клеток, которые могут быть перепрограммированы в индуцируемые плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) (Marchetto et al. 2010) рассматривается как перспективный способ лечения заболевания, который будет доступен уже в обозримом будущем.

Недавно наша группа установила, что у пациентов с типичными формами RTT отмечаются признаки системного окислительного стресса (ОС) и перекисного окисления липидов, наряду с постоянной гипоксией и нарушением газообмена в легких (De Felice et al. 2009).

ОС является частью патогенетических механизмов нескольких заболеваний, связанных с нарушением развития нервной системы, а также нейродегенеративных заболеваний (Halliwell и Gutteridge 1999). Хорошо известно, что липиды мембраны, содержащие длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, являются первичными мишенями для атак реактивного кислорода (ROS) (Morrow et al. 1990; Yin и Porter 2005). Изопростаны (IsoPs), изомеры простагландинов, образующиеся при помощи циклооксигеназы (PGs), являются одним из главным классов продуктов перекисного окисления липидов, генерируемых липидами мембраны в результате реакций свободных радикалов (Morrow и Roberts 1997). В частности, анализ F2 -IsoPs, образующегося при перекисном окислении, катализируемом свободными радикалами арахидоновой кислоты, связанной с фосфолипидами (AA, C20:4 ω-6), считается «золотым стандартом» оценки статуса ОС (Wood et al. 2003; Montine et al. 2004; Montuschi et al. 2004; Comporti et al. 2008; Nourooz-Zadeh 2008; Kadiiska et al. 2005).

Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ω-3 PUFAs), являющиеся антиоксидантами, привлекают все более пристальное внимание исследователей, благодаря разнообразным терапевтическим эффектам и безопасности применения (Lien 2009). В частности, эйкозапентаеновая кислота (EPA, 20:5 ω-3) и докозагексаеновая кислота (DHA, 22:6 ω-3), основная ω-3 PUFAs, содержащихся в рыбьем жире, обладают противовоспалительными, антитромбоцитарными, сосудорасширяющими, гиполипидемическими, а также антиаритмическими свойствами, что свидетельствует о потенциальном положительном плейотропном воздействии на функцию сердечно-сосудистой системы (Kris-Etherton et al. 2002), а также на экспериментальную гипоксию мозга (Belayev et al. 2009). Не так давно появились сообщения о защитном эффекте ω-3 PUFAs в отношении нейротоксических воздействий на нервную систему (El-Ansary et al. 2011).

При естественном прогрессировании RTT, конечно, I стадия является наиболее драматическим событием, характеризующимся неврологической регрессией у нормально развивающейся девочки 6-18 месяцев. В данной работе нами было проведено изучение возможных последствий относительно краткосрочного применения добавок с рыбьим жиром, содержащих ω-3 PUFAs, у пациентов с RTT I стадии, оценка учитывала изменение клинических признаков заболевания и результаты исследований при помощи утвержденных методов измерения уровня биомаркеров перекисного окисления липидов при окислительном стрессе.

Методы

Изучаемая популяция

В общей сложности в исследование было последовательно рекрутировано 20 пациенток с RTT в I стадии заболевания. Критерии включения пациенток в исследование были следующими: клинический диагноз синдрома RTT в I стадии заболевания, отсутствие критериев исключения RTT (Neul et al. 2010), а также доказательство наличия мутации или делеции MeCP2. Соблюдение режима применения добавок контролировался педиатрами, которые были заранее проинформированы о проведении клинического исследования. Мы приняли решение не включать пациенток с вариантами RTT, так как (a) в нашей клинической серии такие пациентки составляли относительно небольшую часть всех девочек с RTT, а также (b) поскольку появляется все больше сомнений, связанных с вариантами RTT: некоторые варианты могут быть связаны с мутациями генов CDKL5 или FOXG1, и в действительности лишь воспроизводят симптомы RTT, не являясь при этом настоящими клиническими формами заболевания (Naidu и Johnston 2011). Это подтверждается данными о статистически значимом различии ОС у пациенток с вариантами RTT (Pecorelli et al. 2011; Leoncini et al. 2011; Signorini et al. 2011).

В исследование также были включены контрольные группы, соответствующие изучаемой группе по возрасту и полу. От испытуемых контрольной группы были получены пробы крови в ходе обычной проверки состояния здоровья.

Дизайн исследования

Это было рандомизированное одиночное слепое исследование, которое проводилось в одном центре. Пациентки были рандомизированы при поступлении в клинику (n = 10 в группе лечения, средний возраст во временной точке «ноль» в отношении использования добавок: 21 ± 6.6 месяцев; n = 10 в группе контроля, средний возраст в точке «ноль»: 20.4 ± 7.3 месяцев). Пациентки получали пероральную добавку ω-3 PUFAs в составе рыбьего жира в течение 6 месяцев, в контрольной группе лечение не проводилось.

Применение EPA в сочетании с DHA при RTT было одобрено Этическим комитетом AOUS.

Все пациентки, включая изученных в ходе исследования, получали стандартную средиземноморскую диету.

Первичные исходы

Первичными исходами были возможные изменения клинических симптомов после применения добавок с ω-3 PUFAs.

Клиническая степень тяжести RTT оценивалась по баллам клинической степени тяжести (CSS), утвержденной клинической шкалы оценки, специально разработанной для RTT (Neul et al. 2008), на основании 13 индивидуальных, числовых категорий, позволяющих количественно измерить клинические признаки характерные для RTT. Все баллы варьируют от 0 до 4 или от 0 до 5, при этом 0 соответствует наименее тяжелой, а 4 или 5 - наиболее тяжелой форме болезни. Было также проведено изучение ряда отдельных клинических компонентов, представляющих интерес, чтобы «сжать» числовые категориальные переменные в бинарные измерения, где 0 соответствует «слабой аномалии» или «сохранной» функции, а 1 - «тяжелой степени болезни» или «утрате/отсутствию функции». Слабая степень тяжести заболевания или сохранные функции констатировали в следующем случае: появление признаков неврологической регрессии после достижения ребенком возраста 18 месяцев, уменьшение веса <2SD, окружности головы больше 10-й процентили после 24 месяцев жизни, сохранение способности сидеть и ходить без посторонней помощи; минимум частичная способность использовать руки, уровень сколиоза <20°: использование ребенком хотя бы отдельных слов, сохранение визуального контакта в течение минимум 5 секунд, наличие минимальной респираторной дисфункции (<10% времени), начальное проявление стереотипии после 36 месяцев жизни, а также отсутствие судорог, или появление судорог реже, чем один раз в месяц. Для того, чтобы более точно количественно определить специфическую переменную CSS «респираторная дисфункция» у всех пациенток было проведено полиграфическое исследование функции дыхания в состоянии бодрствования и сна (полисомнография) (Somnowatch plus, Сомномедикс, Импортер в Италии Линде Медикале срл).

При посещениях для проведения контрольного обследования родителей детей с RTT просили принести записи домашнего видео и/или рисунки дочерей, чтобы сравнить время до и после применения добавок ω-3 PUFAs. Кроме того, родители должны были предоставить информированное согласие на использование частных изображений для целей научного исследования.

Вторичные исходы

Вторичными исходами было потенциальное снижение уровней маркеров ОС в плазме и/или эритроцитов после применения добавки, содержащей ω-3 PUFAs. Использовались такие маркеры как железо небелкового связывания (NPBI) (проокислительный фактор) (Comporti et al. 2002), F2 -IsoPs (конечные продукты окисления AA; маркер ОС/системного перекисного окисления липидов in vivo) (Morrow и Roberts 1997), F2 -дигомо-IsoPs (конечные продукты окисления адреновой кислоты, AdA, C22:4 ω-6, маркер повреждения мембраны глиальной клетки/белого вещества мозга) (VanRollins et al. 2008; De Felice et al. 2011), F3-IsoPs (конечные продукты окисления EPA, маркер перекисного окисления липидов) (Yin et al. 2009), а также F4 -NeuroPs (конечные продукты окисления DHA; маркер повреждения нейрона/серого вещества мозга) (Roberts et al. 1998; Signorini et al. 2011).

ω-3 PUFAs

Омега-3 PUFAs содержались в рыбьем жире «Norwegian Fish Oil AS», Трондхейм, Новергия, номер продукта HO320-6; импортер в Италии: Трансформа АС Италия. Форлимпополи (FC). Италия; регистрационный код в Министерстве Италии: 10 43863-Y), препарат применяли в дозе 5 мл два раза в день ежедневно, это соответствует дозе DHA 72.9 ± 8.1 мг/кг веса тела/день; EPA 117.1 ± 13.1 мг/кг веса тела/день; в общей сложности доза ω-3 PUFAs составляла 246.0 ± 27.5 мг/кг веса тела/день.

Далее приводится химический состав продукта компании «Norwegian Fish Oil» (NFO) по данным производителя, «Norwegian Fish Oil AS», Трондхейм, Новергия:

Средние уровни пероксидов составляли 1.9 (мЭкв. 0.2/кг). В состав этого рыбьего жира добавлены натуральные антиоксиданты в виде концентрата смеси натуральных токоферолов (Covi-Ox T-70 EU). Продукт NFO был подвергнут дезодорированию с применением новой технологии, очищен от содержания тяжелых металлов, PCB, а также диоксинов, при этом остаточные концентрации были в 8-10 раз ниже максимально допустимых уровней, рекомендованных Еврокомиссией.

Получение проб крови

Забор проб крови был проведен у всех пациенток примерно в 8:00 после нахождения в состоянии натощак в течение ночи. В группе получения ω-3 PUFAs забор проб крови был проведен за день до начала применения добавки и через день после завершения установленного 6-месячного периода.

Кровь собирали в пробирки с гепарином, все манипуляции были произведены в течение 2 ч после получения проб. Пробы крови отцентрифугировали при 2400xg в течение 15 минут при комнатной температуре. Плазма без тромбоцитов была сохранена, а лейкоцитарная пленка удалена при помощи аспирации. Эритроциты промыли два раза физиологическим раствором, ресуспендировали в растворе Рингера (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgSO4 , 32 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 1 мМ CaCl2), pH 7.4, в виде 50% суспензии (об/об), а затем использовали для определения десфериоксамин (DFO)-хелатируемого свободного эритроцитарного железа. Плазму использовали для определения уровня F2-IsoPs, F3-IsoPs, F4-NeuroPs,F2-дигомо-IsoPs, а также DFO-хелатируемого свободного железа. Для определени уровня всех изопростанов добавляли бутилгидрокситолуол (BHT) (90 µМ) в плазму в качестве антиоксиданта и хранили в азоте при —70°C до проведения анализа.

NPBI эритроцитов и плазмы

Уровни NPBI в эритроцитах и плазме определяли по содержанию комплекса десфериоксамина (DFO)-железа методом жидкостной хроматографии высокого разрешения в соответствии с методикой, описанной в литературе (De Felice et al. 2009).

Изопростаны (IsoPs)

Содержание F2-IsoPs, F3-IsoPs, F4-NeuroPs, а также F2-ди-гомо-IsoPs, определяли при помощи газовой хроматографии/тандемной масс-спектрометрия отрицательных ионов, полученных при химической ионизации (GC/NICIMS/MS), после экстракции в твердой фазе и нескольких последующих преобразований.

Была получена спайк-проба из каждой пробы плазмы с тетрадейтеризированным простагландином F2α (PGF2α-d4) (500 пг в 50 мл этанола), для использования в качестве внутреннего стандарта. После подкисления (2 мл подкисленной воды, pH 3), были проведены экстракция и очищение. Процесс происходил в два этапа разделения в твердой фазе: сначала использовался октадецилсилановый картридж (C18), затем аминопропиловый картридж (NH2). Преобразование карбоксильной группы привело к получению пентафторбензилированного эфира, тогда как гидроксильные группы участвовали в реакции получения триметилсилиловых эфиров.(Nourooz-Zadeh et al. 1995; Signorini et al. 2003).

При исследовании F2-IsoPs измеренные ионы были производными с m/z 299 и m/z 303, при получении из ионов-предшественников [M-181]- (m/z 569 и m/z 573), первичными веществами были 15-F2t-IsoPs и PGF2α-d4, соответственно (Signorini et al. 2003).

Количественное определение F3-IsoPs проводилось при помощи газовой хроматографии/тандемной масс-спектрометрии отрицательных ионов, полученных при химической ионизации (GC/NICI-MS/MS) в соответствии с новым методом, используемым в нашей лаборатории. Измеренные ионы с m/z 297 и m/z 303 являлись производными, они были получены из ионов-предшественников [M-181]- (m/z 567 и m/z 573), являющихся продуктами реакции окисления EPA и PGF2α-d4, соответственно.

В соответствии с ранее опубликованной статьей (Signorini et al. 2009), для F4-NeuroPs, измеряемые ионы представляли собой производные ионы с m/z 323 и m/z 303, полученные из ионов-предшественников [M-181]- (m/z 593 и m/z 573), которые являются продуктом реакции окисления DHA и PGFα-d4, соответственно. Для F2-дигомо-IsoPs измеряемые ионы представляли собой производные ионы с m/z 327 и m/z 303, полученные из ионов-предшественников [M-181]- (m/z 597 и m/z 573) которые являются продуктом реакции с участием ент-7(RS)-F2t-дигомо-IsoP, 17-F2t-дигомо-IsoP (De Felice et al. 2011), а также PGF2α -d4, соответственно.

Данные анализа

Была проведена проверка всех переменных на нормальность распределения (тест Д’ Агостино-Пирсона (D’Agostino-Pearson)), и данные были представлены как средние значения ± стандартное отклонение (SD) или ± стандартная ошибка среднего (SE) для переменных с нормальным распределением, или медианных средних с интерквартильным интервалом от 25 до 75 для данных, не соответствующих нормальному распределению. Различия между группами были вычислены следующими способами: t тест независимой выборки (для непрерывно нормально распределенных данных), тест на ранжирование сумм Манна-Уитни (Mann-Whitney) (непрерывные данные, не соответствующие нормальному распределению), метод хи-квадрата (категориальные переменные с минимальным количеством случаев на клетку ≥5) теста на точность Фишера (Fishe) (для категориальных переменных с минимальным количество случаев на клетку <5), односторонний анализ вариант (ANOVA), тест на случайность Сьюдента-Ньюмана-Кейлса (Student–Newman–Keuls), или тест Крускалла-Уоллиса (Kruskal–Wallis). Двусторонние значения P<0.05 считались статистически значимыми, если другое не указано. Была проведена коррекция для множественных сравнений (коррекция Бонферрони). Использовалось версия статистического программного обеспечения MedCalc 12.1.4 (МедКалс, Мариакерке, Бельгия).

Результаты

Вторичные исходы

Рис. 1 Изменение клинической степени тяжести после 6-месячного курса применения ω-3 PUFAs у пациенток с RTT I стадии (Общий балл оценки клинической степени тяжести, CSS). CSS оценивали в соответствии по методу Neul et al. 2008. Теоретическое максимальное значение баллов CSS равно 58 (см. электронную таблицу 2 Neul et al. 2008.).

В группе применения добавки наблюдалось значительное уменьшение содержания в плазме F2-дигомо-IsoPs (-86.3%, P<0.0001), F3-IsoPs (-55.15, P = 0.0464), NPBI (-42.2%,P = 0.0005), F4-NeuroPs (-40.3%,P = 0.0437), а также вариабельности значений NPBI в одном эритроците (-46.3%, P = 0.0007), однако не было обнаружено статистически значимого различия по F2-IsoPs (+10.2%, P = 0.16). После применения ω-3 PUFAs уровни вариабельности NPBI при измерении в одном эритроците и F3-IsoPs вернулись к показателям здорового контроля в соответствии с полом и возрастом.

С другой стороны, не было обнаружено статистически значимых различий по каким-либо изученным маркерам ОС в контрольной группе, не получавшей лечения (P C 0.29) (Рис. 2).

Примечания по дизайну исследования

Мы решили проанализировать состояние только пациенток с I стадией заболевания, исходя из того, что потенциально эффективное вмешательство при RTT должно начинаться как можно раньше, то есть, вскоре после поставки клинического и генетического диагноза (стадия I). Небольшая продолжительность I стадии не позволяет провести кроссоверное исследование. Мы также приняли решение на этом этапе исследования не включать группу плацебо по причинам этического характера, так как в нашем предшествующем исследовании (Signorini et al. 2011; Leoncini et al. 2011) мы уже показали клиническое и биохимическое улучшение после применения пероральной добавки этиловых эфиров DHA + EPA.

Обсуждение

Полученные нами данные впервые указывают на статистически значимое снижение степени клинической тяжести заболевания и частичное снижение интенсивности клинических симптомов у девочек с I стадией RTT после применения в течение 6 месяцев добавки рыбьего жира, содержащей ω-3 PUFAs. В частности, такие показатели как двигательные симптомы, дефицит невербальной коммуникации, а также нарушение дыхания, были статистически значимо менее выражены по сравнению с непролеченными пациентами соответствующего возраста. Было обнаружено, что в группе применения добавки наблюдаемое клиническое улучшение связано со статистически значимым уменьшением циркулирующих маркеров ОС/перекисного окисления липидов. Мы наблюдали уменьшение уровней содержания в плазме F3-IsoPs, F2-дигомо-IsoPs, а также F4-NeuroPs, тогда как уровни F2-IsoPs оставались без изменения. Наша гипотеза заключается в том, что более низкие уровни в плазме F2-дигомо-IsoPs, F3-IsoPs, а также F4-NeuroPs, могут с большой степенью вероятности отражать специфические клинические и биологические события, превалирующие у пациенток на ранней стадии заболевания, куда относятся окислительное повреждение мембран нейронов (F4-NeuroPs) и не распознававшееся ранее повреждение белого вещества мозга, вызванное окислительным стрессом (F2-дигомо-IsoPs). С другой стороны, F2-IsoPs, учитывая широкое распространение AA, рассматривается как индекс генерализованного системного перекисного окисления липидов. Возможно также, что для достижения статистически значимого изменения этого параметра нам потребовалось бы лечить пациенток в течение более длительного периода времени. Важность длительности лечения была показана в нашей предшествующей работе по изучению влияния ω-3 PUFAs на уровни ряда маркеров ОС в плазме и эритроцитах у пациенток с RTT с более поздними стадиями заболевания (III и IV), при этом наблюдалось статистически значимое снижение F2-IsoPs в плазме (см. Рисунок 4 в работе Leoncini S. et al. 2011). Следует отметить что в течение 12 месяцев применялись ω-3 PUFAs в виде этиловых эфиров; соотношение EPA-DHA составляло примерно 1.5; средняя доза: 20–40 мг/кг веса тела/день.

Рис. 2 Изменение уровней содержания железа небелкового связывания и изопростанов после 6-месячного курса применения добавки ω-3 PUFAs у пациенток с RTT I стадии. Уровни содержания F2-дигомо-IsoPs в плазме (средние значения ± SE) представлены в логарифмической форме. Обозначения P-NPBI, уровни NPBI в плазме (нмоль/мл); IE-NPBI, показатели измерений NPBI одного эритроцита (нмоль/мл); mo.s, месяцы. Все различия в группе лечения RTT (до и после применения добавки), с учетом периода отсутствия лечения RTT (временные точки 0 и 6 месяцев), а также по сравнению со здоровыми детьми из группы контроля, были статистически достоверны. *P = 0.10 по сравнению со здоровыми детьми из группы контроля; **P = 0.567 по сравнению со здоровыми детьми из группы контроля.

Хотя всегда нужно помнить, что наличие связи не обязательно указывает на причинно-следственные отношения, полученные нами данные свидетельствуют о существовании тесной взаимосвязи между уровнями циркулирующих биомаркеров ОС у пациенток с RTT и присутствием симптомов, что убедительно доказывает концепцию, согласно которой повреждение вследствие окислительного стресса играет неизвестную ранее, но ключевую роль в патогенезе RTT/дефицита MeCP2. В ходе ранее проведенного нами исследования мы уже продемонстрировали частичное клиническое и биохимическое улучшение у пациенток с RTT после применения добавки с DHA и EPA в виде этиловых эфиров (Signorini et al. 2011; Leoncini et al. 2011), хотя не наблюдалось улучшения в виде сохранности основных функций: не удалось добиться восстановления утраты приобретенных полезных целевых навыков владения рукой.

В данном исследовании определение дозы PUFAs, содержащихся в рыбьем жире, было основано на эмпирических данных и клинической интуиции врача, имеющего опыт лечения RTT (J.H.). Хотя ежедневная доза ω-3 PUFAs на кг веса тела, использованная в данном случае, была примерно в семь раз выше (EPA: в 7.3 ± 3.4 раза; DHA: в 6.8 ± 3.2 раза), чем доза, использованная в предшествующих исследованиях, где оценивалось состояние пациенток с RTT с более поздними стадиями заболевания (тогда применялись этиловые эфиры EPA и DHA) (Leoncini et al. 2011; Signorini et al. 2011), нами не было отмечено каких-либо проблем, связанных с безопасностью или соблюдением режима применения добавки.

Нам удалось получить впечатляющие данные, так как до настоящего времени фактической остановки прогрессирования заболевания удавалось добиться только при проведении экспериментов на животных при помощи восстановления функции MeCP2, то есть, за счет возобновления экспрессии гена MeCP2 в нейронах и глиальных клетках у мышей с отсутствием MeCP2 (Guyet al. 2007). При этом частичное снижение интенсивности симптомов у мышей с RTT отмечалось при воздействии экзогенного IGF-1 (Tropea et al. 2009).

Недавно была оспорена справедливость представления об RTT как об исключительной неврологическом заболевании, так как были получены результаты исследований, указывающие на вовлечение глиальных клеток в патогенез, вызываемый дефицитом MeCP2 (Maezawa et al. 2009; Ballas et al. 2009; Zoghbi 2009). Предположение о вовлечении глиальных клеток согласуется с данными этого исследования, а также с результатами предшествующих работ, где нами было показано увеличение на 2 порядка уровня содержания F2-дигомо-IsoPs у пациенток с RTT I стадии (De Felice et al. 2011), что, скорее всего, отражает наличие повреждения белого вещества мозга вследствие окислительного стресса (VanRollins et al. 2008).

Указанные изопростаны являются продуктами окисления AdA, специфического компонента миелина, также присутствующего в нескольких органах и тканях (Sastry 1985; VanRollins et al. 2008; Sprecher et al. 1982). Интересно отметить, что некоторые неврологические признаки I стадии RTT, такие как снижение когнитивной функции до уровня деменции, нарушение двигательной активности, афазия и апраксия, перекрываются с симптомами адренолейкодистрофии, связанной с X хромосомой (X-ALD). Это редкое наследственное заболевание, поражающее, преимущественно, белое вещество мозга у мужчин, ведущее к прогрессирующему повреждению мозга, недостаточности функции надпочечников, а в итоге – к летальному исходу (Cappa et al. 2011). Интересно отметить, что подтверждение первичного повреждения мозга, связанного с ОС, также отмечено при X-ALD (Fourcade et al. 2008; Galino et al. 2011), как и улучшение клинических симптомов у пациенток (Kawashima et al. 2011). Зафиксирована также остановка дегенерации аксонов у мышей с X-ALD после терапевтического применения антиоксидантов (Lo´pez-Erauskin et al. 2011) или действия экзогенного IGF-1 (Mastroeni et al. 2009), что удивительным образом увеличивает сходство между RTT и X-ALD. Таким образом, вполне можно представить, что улучшение двигательной функции (продуктивность движения/способность находиться в положении сидя, использовать руки, способность ходить без посторонней помощи) и удержание внимания (невербальная коммуникация), наблюдаемое на ранней стадии RTT после применения добавки, содержащей ω-3 PUFAs, по крайней мере отчасти, связано с уменьшением повреждения белого вещества мозга на данной стадии заболевания. Более того, интересно отметить, что не распознаваемое ранее повреждение белого вещества мозга в действительности происходит и связано с нарушением речи (Mahmood et al. 2010; Zoghbi 2009).

При изучении серии клинических случаев нами было установлено, что речь улучшилась после применения в течение 6 месяцев пероральной добавки с ω-3 PUFAs, хотя различие по баллу оценки тяжести заболевания в отношении показателя речи во временной точке 0 не достигло уровня статистической значимости (P = 0.0649). Можно придти к заключению, что частичное снижение интенсивности повреждения белого вещества мозга на ранней стадии заболевания может отражаться в форме значительного улучшения невербального общения.

С другой стороны, отсутствие статистически значимых изменений по соматическим параметрам и, особенно, окружности головы, не ожидалось, учитывая относительно короткую продолжительность лечения.

Хорошо известно, что ω-3 PUFAs обладают антиоксидантной активностью, характеризуемой рядом положительных эффектов, при этом появляется все больше данных о нейропротекторных свойствах этих кислот при нескольких заболеваниях человека, включая психические расстройства (McNamara 2010), положительные результаты были получены и при экспериментальном моделировании заболеваний у животных (Zhang et al. 2011; Chang et al. 2009; Bazan 2007). Однако молекулярные механизмы действия ω-3 PUFAs изучены только частично, к ним относится изменение структуры мембраны и экспрессии генов, непосредственное взаимодействие с ионными каналами, а также изменение синтеза эйкозаноидов (Chapkin et al. 2008; Jump 2002; Deckelbaum et al. 2006; Xiao et al. 2005; Calder 2006; Serhan et al. 2008). EPA и DHA - это основные ω-3 PUFAs, которые, как известно, определяют физическое состояние клеточных мембран, а также ответные реакции организма.